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關于紫外交聯儀的使用步驟盡在本篇

更新時間:2023-01-09   點擊次數:1745次
  紫外交聯儀的主要用途為在膜上交聯核酸,其是一種254mm紫外輻射系統,其有很多用途,UV滅菌消除PCR污染、嘧啶二聚體產生的部分限制性內切酶消化、RecA突變篩選以及瓊脂糖凝膠中DNA的切割等亦是其用途。其的應用價值也體現在聚合物紫外處理和紫外滅菌等方面。
 
  以下為紫外交聯實驗的步驟,一起來看看吧
 
  1、混合10μL含有高親和性蛋白結合位點的目的序列的單鏈M13載體和等摩爾的17bpM13通用引物,使用1×限制性內切核酸酶緩沖液調節終體積到100μL。在90攝氏度下加熱5分鐘。在室溫下冷卻、
 
  2、在雜交混合物中加入Klenow酶5μL、水7μL、10×限制性內切核酸酶緩沖液7.5μL、0.1mol/L二硫蘇糖醇1.75μL、50×dNTP/BrdU溶液3.5μL、[α32P]dCTP50μ等反應物,在16攝氏度下溫浴90分鐘。
 
  3、在68攝氏度下加熱10分鐘,將Klenow酶滅活。
 
  4、使用40U限制性內切核酸酶在合適條件下消化,使得20600bp的DNA片段產生。
 
  5、將乙酸銨添加到0.3mol/L,DNA使用2倍體積的1**%乙醇進行沉淀,在TE緩沖液中重懸。
 
  6、電泳在含有0.5μg/mL溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上進行。所要的DNA片段使用DEAE膜進行分離。
 
  7、BrdU取代的DNA片段的特異活性使用閃爍計數器進行檢測,DNA的濃度的估計采用溴化乙錠點跡定量法。能夠采用遷移率變動DNA結合分析法來檢測探針的完整性和功能。
 
  8、將下列結合反應建立于1.5mL圓底小瓶中:將10-20μgDNA載體、經緩沖的含有結合蛋白的提取液以及105cpm均衡標記的探針混合,調節總體積到50μL。瓶口使用塑料薄膜封住,固定再采用Parafilm膜加封。
 
  9、在試管架上放上小瓶,于正上方5厘米處使用倒置的紫外透射燈照射1個小時。
 
  10、將1U微球菌核酸酶、DNA酶I4μg、0.5mol/LCaCl21μL等反應物加入到各結合反應管中,在37攝氏度下消化半個小時。
 
  11、在反應混合物中加入等體積的2×SDS樣品緩沖液,在100攝氏度中煮沸5分鐘。
 
  12、樣品的電泳在適當濃度的不連續SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行。
 
  13、完成電泳之后,將凝膠前沿的染料切去。
 
  14、干膠,使用增感屏放射自顯影13日,來對交聯的蛋白質進行觀測。
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